خلاصة
أحدث التطور في علم الأحياء البردي في تربية الحيوانات ثورة في هذا المجال
من الطب الإنجابي. الهدف الرئيسي هو الحفاظ على الأصول الوراثية الحيوانية
لأسباب متنوعة مثل الحفاظ على أنواع الحيوانات المهددة بالانقراض، والحيوان
التنوع، وزيادة الطلب على النماذج الحيوانية و/أو المعدلة وراثيا
الحيوانات للأبحاث المتعلقة بالأمراض الحيوانية والبشرية. الحفظ بالتبريد لديه
ظهرت كتقنية واعدة للحفاظ على الخصوبة وتقنيات الإنجاب المساعدة (ART) لإنتاج السلالات الحيوانية والمهندسة وراثيا
أنواع الحيوانات للبحث. التجميد البطيء والتجميد السريع/التزجيج سريعان
الطريقتان الرئيسيتان للحفظ بالتبريد. يتميز التجميد البطيء بـ
انتقال الطور (تحول السائل إلى مادة صلبة) عند خفض درجة الحرارة أدناه
نقطة التجمد. ومن ناحية أخرى، فإن التزجيج هو ظاهرة يحدث فيها السائل
يتصلب دون تكوين بلورات ثلجية، وبالتالي يشار إلى العملية باسم أ
التحول الزجاجي أو الحفظ بالتبريد الخالي من الجليد. يتم تطبيق بروتوكول التزجيج بدرجة عالية
تركيزات من العوامل الواقية من البرد (CPA) المستخدمة لتجنب الإصابة بالتبريد. يقدم هذا الفصل لمحة موجزة عن أساسيات الحفظ بالتبريد وأسسها
الطرق المعتمدة في الحفظ بالتبريد. الاستراتيجيات المتبعة في حفظ الجراثيم بالتبريد
ويدخل في هذا الفصل الخلايا (تجميد الحيوانات المنوية والبويضات). يصف القسم الأخير
الحدود وتطور الحفظ بالتبريد في بعض الحيوانات المهمة
نماذج مثل القوارض (الفأر والجرذان) وفي عدد قليل من الحيوانات الكبيرة (الأغنام والبقر وغيرها).
الكلمات المفتاحية: الحفظ بالتبريد، الخصوبة، التكاثر، البيولوجيا بالتبريد
1 المقدمة
منذ تطور الإنسان وحضارته، ظل الإنسان يستغل
الحيوانات إما للطعام أو النقل أو كمرافقين. استخدام الحيوانات في
لقد أدت الأبحاث الطبية الحيوية والسلوكية إلى زيادة المعرفة العلمية بشكل كبير
وقد أفاد صحة الإنسان بشكل كبير. استغرق التقدم الهائل
مكان في مجال العلوم الطبية مع إمكانية استخدام الحيوانات للبحث التجريبي. حاليًا، يتم استخدام حوالي 75-100 مليون من الفقاريات سنويًا
البحث والاختبار [1]. الحيوانات الأكثر استخدامًا هي الفئران والجرذان
تشكل حوالي 95% من حيوانات التجارب؛ الماوس هو الأكثر
حيوان شائع الاستخدام في الأبحاث الطبية الحيوية [1]. يتم استخدام النماذج الحيوانية في
البحث من أجل فهم أوسع للعمليات الفسيولوجية الحيوية في الإنسان و
الحيوانات. النماذج الحيوانية مفيدة أيضًا في التحقيق في الأمراض المختلفة بما في ذلك
الاضطرابات الأيضية مثل مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) والاضطرابات
في أمراض الغدد الصماء التناسلية والعقم والسرطان والأمراض المعدية [2-7].
تمت استعادة حياة البشر المعرضة للخطر بسبب فشل الأعضاء بعد نجاح العضو
زرع أنجزت في النماذج الحيوانية. تعظيم الاستفادة من الحفظ بالتبريد
سوف تسهل البروتوكولات بشكل كبير زرع الأعضاء و/أو استبدالها. في
بالإضافة إلى ذلك، الحيوانات مثل الكلاب والخنازير والقطط والأغنام والقرود غير البشرية (NHP) والأسماك
تستخدم على نطاق واسع للدراسات الوراثية والفسيولوجية في صحة الإنسان والأمراض
[8]. يركز الفصل على أساسيات علم الأحياء البردي واستراتيجياته
حفظ خصوبة الذكور (الحيوانات المنوية) والأنثى (أنسجة المبيض والبويضة) بالتبريد.
ويركز القسم الأخير على الحدود في مجال الحفظ بالتبريد الأكثر استخدامًا على نطاق واسع
النماذج الحيوانية مثل القوارض والحيوانات العليا المستخدمة في البحوث الطبية الحيوية و
الدراسات السمية.
1.1 ضرورة الحفظ بالتبريد للموارد الوراثية الحيوانية؟
أعداد كبيرة من سلالات الحيوانات في جميع أنحاء العالم إما انقرضت أو مهددة بالانقراض
مع القليل منها على وشك الانقراض. ومن ثم، فمن الأهمية بمكان تطوير وتطبيق الإنقاذ
استراتيجيات لضمان بقاء هذه الأنواع في المستقبل. إحدى الطرق هي الحفاظ
الموارد الوراثية أو المادة الوراثية لهذه الأنواع من أجل صيانتها و
تطويرات مستقبلية. التنوع الوراثي هو تهديد آخر ناتج عن الحيوان
أخطاء التربية التي يمكن أن تؤدي إلى الانجراف الوراثي للمستعمرات الموجودة والوراثة
تلوث الخطوط علاوة على ذلك، تعتبر الكوارث الطبيعية المرتبطة بالطقس كارثة كبرى
تهديد تربية الحيوانات والحظيرة، خاصة في حالة حيوانات التجارب التي تتطلب رعاية خاصة في مستعمرات التربية والتربية. يتم تعديل صناعات الماشية وتربية الماشية لإنتاج الأنواع الحيوانية على نطاق واسع.
هناك حاجة ملحة لتحسين كفاءة واستدامة الإنتاج
الحيوانات من أجل الغذاء في مواجهة الزيادة المستمرة في عدد سكان العالم. تحسين
يعد فهم آليات وتحديات التقنيات الإنجابية أمرًا حيويًا
لتحسين جدوى صناعة الثروة الحيوانية [9]. وبالتالي حل واحد ل
يتم الحفاظ على الأنواع الحيوانية عن طريق التجميد. وقد ظهر الحفظ بالتبريد باعتباره الأكثر
طريقة فعالة ومتوافقة لتجميد الموارد الوراثية البشرية والحيوانية
[10]. علم الأحياء البردي هو دراسة متكاملة لمختلف العلوم البيولوجية والفيزيائية.
يمكن تخزين السائل المنوي والأجنة والبويضات والخلايا الجسدية والحمض النووي النووي وأنواع أخرى من المواد البيولوجية مثل الدم والمصل والأنسجة باستخدام الحفظ بالتبريد.
وذلك للحفاظ على المواد الوراثية أو لتطبيقات أخرى [8، 11]. الابتدائي
فائدة الحفظ بالتبريد هي القدرة على حفظ البلازما الجرثومية لفترات طويلة
الزمن، وبالتالي الحفاظ على التنوع الجيني للنوع أو السلالة [12].
وأيضا، الأصول الوراثية للحيوانات المعدلة وراثيا (GEA) وخطوط الخلايا المختلفة
يمكن الحفاظ على الأنواع عن طريق طريقة الحفظ بالتبريد. بنوك الجينات / بنوك التبريد هي
أنشأ ويحتوي على مستودع للموارد الجينية المحفوظة بالتبريد لتجديد مجموعة معينة من السكان في المستقبل [13-15]. تم حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد
تم تطبيقه بنجاح في مختلف المجالات لصالح الإنسان والحيوان. من رئيس الوزراء
أهمية، تكنولوجيا المساعدة على الإنجاب (ART)، طليعة في علاج العقم
قد يكون العلاج اليوم غير ممكن دون الحفظ بالتبريد الفعال
التقنيات.
1.2 التاريخ وراء الاكتشاف
ملاحظة سبالانزاني في بداية تبريد الثلوج في القرن الثامن عشر
كان الحيوان المنوي طفرة في مجال علم الأحياء. تم العثور على الحيوانات المنوية للحفاظ عليها
القدرة على الحركة والقدرة على البقاء حتى عند تعرضها لظروف درجات الحرارة الباردة [16].
وفي وقت لاحق، في القرن التاسع عشر، حدث تقدم كبير مع النجاح
يتم إجراء تلقيح الماشية باستخدام العينات المحفوظة بالتبريد. بروتوكول ناجح
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
تم تطوير تقنية تجميد الحيوانات المنوية وتخزينها في درجات حرارة منخفضة (-79 درجة مئوية) بواسطة
بولج وآخرون، [17]. كانت الحيوانات المنوية أول خلية ثديية يتم تحقيقها بنجاح
مجمدة [18]. ارتبط هذا النجاح الكبير في تجميد الحيوانات المنوية بـ
اكتشاف الجلسرين كمادة وقائية من قبل بولج وآخرون في عام 1949 [17]. منذ عام 1970
وحتى الآن، لن يكون الحفظ بالتبريد إجراءً ناجحًا للحفظ في
الطب التناسلي دون اكتشاف القش البلاستيكي وأنابيب التبريد
تتحمل درجات الحرارة المنخفضة للغاية المستخدمة في تعبئة الحيوانات المنوية. تجميد أجنة الفئران
تم الإبلاغ عن استخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كمادة وقائية للتبريد في عام 1972 بعد ذلك
نجح في حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد [19].
2. فن تجميد الحياة
2.1 طرق الحفظ بالتبريد
تتضمن طريقة الحفظ بالتبريد والاسترداد الخطوات التالية. بدءًا،
تتم معالجة الخلايا باستخدام عوامل الحماية من البرد (CPAs) لمنع الإصابة بالتبريد/التلف.
وفي وقت لاحق، يتم تبريد الخلايا بطريقة خاضعة للرقابة عند درجات حرارة تحت الصفر، حيث يتم
تتوقف العمليات الأيضية للخلية. انتعاش الخلايا يتبع عكس
إجراء؛ يتم إذابة الخلايا بسرعة ومن ثم تتم إزالة CPAs تدريجيا. ال
يتم تعزيز صلاحية العينة المحفوظة بالتبريد باستخدام CPA المناسب
النوع والتركيز ونسبة التجميد المناسبة [10].
تشمل الطريقتان الأساسيتان للحفظ بالتبريد الطريقة التقليدية البطيئة
التجميد (SF) وطريقة التجميد السريع المعروفة بالتزجيج (Vit). هؤلاء
تتطلب البروتوكولات تركيزات مختلفة من CPA وتطبق معدلات تبريد مختلفة.
ويوضح الشكل 1 طريقتين للحفظ بالتبريد.
شكل 1.
مقارنة بين طريقة التجميد البطيء والتزجيج.
2.1.1 التجميد البطيء
يتضمن التجميد البطيء التبريد التدريجي للعينة على مدار فترة تتراوح من 2 إلى 4 ساعات
إما يدويًا أو تلقائيًا باستخدام فريزر شبه قابل للبرمجة. هذه الطريقة
تم تطويره بواسطة بيرمان وساودا [20]. في SF، يحدث انتقال المرحلة من
السائل إلى الصلب عند درجات حرارة أقل من نقطة التجمد. تتضمن بروتوكولات التبريد البطيء
استخدام أقل من 1.0 م من العوامل الواقية من البرد (CPAs)، مثل الجلسرين أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، والتي لها سمية ضئيلة عند درجات حرارة منخفضة مع الاستخدام.
لفريزر عالي التكلفة يمكن التحكم فيه أو حاوية تجميد محمولة توضع على الطاولة [21].
الميزة الرئيسية لـ SF هي تقليل خطر التلوث أثناء الإجراء،
دون الحاجة إلى محترفين ذوي مهارات عالية. ومع ذلك، SF لديه العديد من العيوب. إنها تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة. هناك خطر كبير للإصابة بالتبريد بسبب
تشكيل الجليد خارج الخلية. على الرغم من أن التبريد البطيء يعتبر ناجحًا
الطريقة، فإن نسبة النجاح منخفضة إلى حد كبير وقد لا تكون مناسبة لجميع الأنواع
الخلايا والأنسجة [22] . SF هي طريقة شائعة الاستخدام للحفاظ على الحيوانات
المادة الوراثية لغالبية حيوانات المزرعة مثل الأغنام والبقر والزرد وما إلى ذلك [23، 24].
على الرغم من وجود بعض العيوب، فقد تم العثور على طريقة SF أكثر كفاءة
لحفظ أجنة الأغنام بالتبريد مقارنة بالتزجيج [25].
2.1.2 التزجيج أو الحفظ بالتبريد بدون ثلج
للتحايل على عملية تبلور الجليد، تكلفة ومدة الحفظ بالتبريد في SF، تم استخدام تقنية بديلة تسمى التجميد السريع أو التزجيج
تم تطوير (فيت). Vit هي طريقة تبريد فائقة السرعة ذات معدل تبريد مرتفع،
مما يمكن من وضع الخلايا في درجات حرارة مبردة، لتكوين ما يعرف
كواجهة جليدية، مع تجنب تبلور الجليد، ومن ثم يطلق عليها أيضًا اسم خالية من الجليد
الحفظ بالتبريد. التزجيج هو الآن البروتوكول الموصى به للأجنة و
تجميد الخلايا. وتشمل العملية تبريد الخلايا أو الأنسجة إلى درجات حرارة مبردة باستخدام النيتروجين السائل، بعد تعرضها لتركيزات عالية من CPAs،
مع التبريد السريع اللاحق لتجنب نواة الجليد [11]. تعليق الخلية
تتحول مباشرة من الطور المائي إلى الحالة الزجاجية عند التعرض لها
LN2. يعمل تركيز CPA العالي ومعدلات التبريد والتدفئة الأعلى على التخلص من الجليد
التكوين [26]. عدة عوامل مثل اللزوجة أو سمك العينة والتبريد
ومعدلات الاحترار وحجم العينة ونوع CPA وتركيزها كبيرة
تأثير على العملية. وبالتالي، فإن التوازن بين جميع العوامل المهمة مطلوب لنجاح التزجيج. التزجيج نوعان: متوازن وغير متوازن.
يُطلق على صياغة مخاليط CPA متعددة الأقطاب وحقنها في المعلقات الخلوية اسم تزجيج التوازن. يشمل التزجيج غير المتوازن
استخدام المواد الحاملة مثل القش البلاستيكي أو الكريولوبس للحصول على الحد الأدنى من الانخفاض
أنظمة خالية من الحجم والناقل تستخدم معدل تجميد أعلى وتكلفة اكتساب أقل
تركيز المزيج. بالمقارنة مع التجميد البطيء، يعد التزجيج أكثر فائدة لأنه يرتبط بانخفاض خطر الإصابة بالتبريد، وبالتالي ضمان معدل بقاء أعلى للخلايا بشكل كافٍ [11]. تجدر الإشارة إلى أنه لا يوجد بروتوكول عالمي متبع
للأنواع الحيوانية. ومع ذلك، فإن الخلايا الجرثومية من أنواع مثل مبيض الفأر [27]، والأسماك
تم حفظ الأجنة [28] والأغنام المبيضية [29] والعديد من الأنواع الأخرى بالتبريد
عن طريق التزجيج [24].
2.2 تقنيات الحفظ بالتبريد الناشئة الأخرى
2.2.1 التزجيج المتحكم فيه عن طريق تتبع السائل (LT)
تتبع Liquidus (LT) هو بروتوكول تزجيج بطيء ومتحكم به
زيادة تدريجية في تركيز الحماية بالتبريد في وقت واحد مع
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
الانخفاض المستمر في درجة الحرارة عند نطاقات تحت الصفر بمعدل محدد.
مع LT، تم تحقيق استعادة واستعادة الخلايا الغضروفية بنجاح
من الغضروف المفصلي المحفوظ بالتبريد [30] وكانت النتائج واعدة
تم الإبلاغ عنها في حالة حفظ أنسجة المبيض بالتبريد [31]. مبدأ LT هو
التحكم الديناميكي في تركيزات CPA، طوال عملية التبريد،
من أجل الحفاظ على الخلية فوق نقطة التجمد في جميع الأوقات، دون
تكوين الجليد [11]. على سبيل المثال، حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC)
تم الإبلاغ عن نجاح LT في استعادة وظيفة المبيض في الأغنام
نموذج [29].
2.2.2 التزجيج النبضي بالليزر
اقترح فاولر وتونر إمكانية تطبيق ضوء الليزر في الحفظ بالتبريد
عملية. تم التعافي بنجاح من خلايا الدم الحمراء المجمدة بسرعة عن طريق التزجيج
يتم تحقيقها دون استخدام CPAs. في المقام الأول، يستهدف الليزر الخلايا داخل الخلايا فقط
الجليد مما يؤدي إلى ذوبانه وإعادة تماسكه إلى الحالة الزجاجية. بعد الذوبان واستخدام الليزر
الضوء، بقي حوالي 80٪ من الخلايا المعالجة قابلة للحياة [32]. وفي محاولة جين وآخرون، [33]
تم الإبلاغ عن الناجين الكاملين من بويضات الفأر بعد التزجيج في الوسائط المخففة 3 أضعاف
والاحترار السريع للغاية بواسطة نبضة ليزر الأشعة تحت الحمراء [33].
2.2.3 الحفظ بالتبريد المتساوي والضغط العالي
النهج الجديد في طريقة الحفظ بالتبريد هو التجميد تحت الضغط.
استخدمت الطريقة السابقة التي تمت مناقشتها أعلاه ظروف ضغط ثابت قياسي (متساوي الضغط) بالقرب من ضغط جوي واحد. التبريد المتساوي (الحجم الثابت).
يوفر وسيلة لخفض درجات حرارة التخزين غير المجمدة بشكل ملحوظ دون
أي أو مع الحد الأدنى فقط من متطلبات CPA، مما يحقق قدرًا أكبر من التمثيل الغذائي
تخفيض دون إصابة مرتبطة بالتجميد أو سمية CPA أو زيادتها
كميات المذابات الاسموزية. الحفظ بالتبريد متساوي المشيمة هو على مرحلتين
عملية التوازن، حيث يوجد الجليد والسائل في وقت واحد في حالة توازن
تحت درجة حرارة وحجم ثابتين، في حين أن الحفظ بالتبريد عالي الضغط
يتم الحفاظ على المحلول في مرحلة واحدة كسائل، ومع ذلك فإن معدل البقاء على قيد الحياة هو
منخفض في هذه الطريقة [34]. تم حفظ كرات الدم الحمراء بالتبريد بنجاح بهذه الطريقة
[35]. وعلى الرغم من المحاولات المتعددة، لم يتمكن العلماء من حفظها بالتجميد
استعادة الوظائف الطبيعية للعينات الحيوية المعقدة، مثل أنسجة الثدييات
والأعضاء.
2.3 أساسيات الحفظ بالتبريد والإصابات بالتبريد
قبل فهم دور عوامل الحماية من البرد (CPAs)،
تأثير درجات الحرارة تحت الصفر على الأنسجة السليمة والمبادئ الأساسية في
يجب أن يكون علم الأحياء البردي على دراية. كما هو معروف، الماء هو واحد من أهمها
العناصر الموجودة في كل خلية ونسيج وعضو من الكائنات الحية على وجه الأرض.
ويشكل حوالي 80٪ من كتلة الأنسجة [36]. عند خفض درجة الحرارة، الماء
يمر بمرحلة انتقالية (السائل إلى الصلب) ويؤدي إلى تبلور الجليد. ال
يؤدي تكوين الجليد داخل الخلايا إلى تلف البنية الخلوية ووظيفتها
وبالتالي يؤدي إلى الإصابة بالتبريد. يمكن أن يسبب التجميد نوعين من الآثار الضارة
على الخلايا. يؤدي تكوين بلورات الثلج إلى إتلاف غشاء الخلية وبالتالي استعادته
من الخلايا السليمة هيكليا على ذوبان سيكون من الصعب. وعلاوة على ذلك، تشكيل الجليد
يزيد من تركيز المذاب مما يؤدي إلى خلل في التوازن الأسموزي وتلف الخلايا. لتقليل أو تخفيف هذه الآثار، هناك إجراءان وقائيان. اختيار
يجب أن تكون مادة الحماية من البرد فعالة، ويجب أن تكون معدلات التبريد والذوبان مناسبة
باشر.
2.3.1 عوامل الحماية من البرد (CPAs)
كان اكتشاف CPA ودوره في الحد من الإصابة بالتبريد خطوة مهمة
في نجاح الحفظ بالتبريد. المقبولية البيولوجية، اختراق الخلايا، سمية منخفضة،
هي بعض الخصائص التي يجب أن يمتلكها CPA. كما ذكرنا في القسم السابق،
يعتمد أفضل معدل لبقاء الخلايا والأنسجة على تحسين عوامل مثل
معدل التبريد، معدل الاحترار، حجم العينة. يعد تركيز CPA عاملاً رئيسياً
التأثير على نجاح الحفظ بالتبريد [37]. على أساس اختراقهم
القدرات من خلال غشاء الخلية، يتم تصنيف CPAs إلى فئتين - غشاء نفاذ/منفذ وغشاء كتيم/غير متخلل.
2.3.1.1 اختراق اتفاقيات السلام الشامل
تكون CPA المتخللة أصغر حجمًا (عادةً أقل من 100 دالتون)، و
ذات طبيعة برمائية [38]. وبسبب هذه الخصائص يمكن لهذه الجزيئات أن تخترق
من خلال غشاء الخلية بسهولة، وتميل إلى التوازن داخل السيتوبلازم و
استبدال المياه داخل الخلايا لتجنب الجفاف المفرط. من الآن فصاعدا،
أنها تحمي الخلية من تكوين الجليد داخل الخلايا (IIF) وتراكم الملح. ومن أمثلة اتفاقات السلام الشامل في هذه الفئة: الجلسرين (أول عامل اكتشف)،
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، إيثيلين جلايكول (EG)، وبروبانديول (بروبيلين
جلايكول) [39]. يرجع الدور الوقائي لـ CPA إلى الارتباط الهيدروجيني بالماء
الجزيئات، وخفض درجة تجمد الماء. ونتيجة لذلك، يتوفر عدد أقل من جزيئات الماء للتفاعل مع نفسها لتكوين مواقع النواة المهمة
اللازمة لتكوين البلورات [40]. لتقليل السمية، يتم استخدام مخاليط التزجيج
غالبًا ما يتم إضافتها بطريقة تدريجية عند درجات حرارة قريبة من 0 درجة مئوية. إضافة تتخلل
تمنع العوامل تكوين الجليد وتسمح بتخزين الخلايا في درجات حرارة فائقة البرودة. إلى جانب التزجيج، فإن القليل من CPA، على سبيل المثال DMSO، لها خصائص لتعزيز
نفاذية الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة. تم الإبلاغ عن DMSO بحوالي 5٪
زيادة النفاذية عن طريق تقليل سمك غشاء الخلية. [دمس] في
يعتبر تركيز 10% أكثر فعالية ويستخدم بشكل شائع لأنه يحفز مسام الماء
تشكيل في الأغشية البيولوجية. وبالتالي يمكن استبدال الماء داخل الخلايا بسهولة
بواسطة CPAs لتعزيز التزجيج. ومع ذلك، عند التركيزات العالية السامة (40%)،
تبدأ طبقات الدهون الثنائية في التفكك [41]. وبالتالي فإن اختيار تركيز CPA المناسب يعد أمرًا حيويًا للحفاظ على السلامة الهيكلية والقدرة على البقاء بعد التجميد.
2.3.1.2 العوامل غير النفاذة
على عكس العوامل النافذة، فإن العوامل غير النافذة هي عبارة عن ثنايا وقواطع مرتبطة تساهميًا
أو البوليمرات ذات الحجم الأكبر. لا يمكنهم المرور عبر غشاء الخلية و
تمارس تأثيرها الوقائي خارج الخلية. الأكثر شيوعا غير اختراق
CPAs هي البولي إيثيلين جلايكول (PEG)، والبولي فينيل بيروليدون (PVP)، والرافينوز،
السكروز، والتريهالوز [42، 43]. طريقة عمل العوامل غير المتخللة هي
يشبه العوامل المتخللة من خلال التحكم في الأسمولية ولكنه يعمل خارج الخلية
وبدرجة أقل.
قائمة بالعوامل المختلفة المستخدمة للوقاية من البرد المتخللة وغير المتخللة
في حفظ الأمشاج والأجنة بالتبريد في الأنواع المختلفة مدرج في الجدول 1.
إلى جانب هذه CPAs شائعة الاستخدام، يوجد بروتين مثل السيريسين من دودة القز والصغيرة
البروتينات المضادة للتجمد المشتقة من الكائنات البحرية أو الأسماك قد حظيت أيضًا بالاهتمام باعتبارها CPAs في علم الأحياء البردي [11].
2.3.2 معدلات التبريد والذوبان
يعد اختيار معدلات التبريد والذوبان المناسبة خطوة حيوية أخرى لنجاح الحفظ بالتبريد. لقد أثبت مازور [44] في السابق أهمية ذلك
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
الجدول 1.
قائمة بمختلف المواد الواقية من البرد المتخللة وغير المتخللة المستخدمة في تقنيات الإنجاب المساعدة.
العلاقة بين معدلات التبريد وبقاء الخلايا المختلفة [44]. ال
كان معدل التبريد يتناسب طرديا مع تكوين الجليد داخل الخلايا وعكسيا
يتناسب مع البقاء على قيد الحياة بين الخلايا المختلفة. ويوضح الشكل 2 البقاء على قيد الحياة
لعدة أنواع من الخلايا بعد الحفظ بالتبريد فيما يتعلق بمعدل التبريد. جميع الخلايا
أظهر منحنى مميزًا مقلوبًا على شكل حرف U يشير إلى البقاء على قيد الحياة
ويزداد معدل البقاء مع زيادة معدل التبريد حتى نقطة بعدها البقاء على قيد الحياة
يتناقص تدريجيا. تجف الخلايا الأكبر حجمًا ببطء مقارنة بالخلايا الأصغر.
الشكل 2.
منحنى شكل U مقلوب يوضح العلاقة بين معدل التبريد وبقاء الخلية (مقتبس من
مقال بقلم سيبري وآخرون، [45]؛ تم إنشاء الشكل في الأصل بواسطة Critser وMobraaten [46] في مجلة ILAR).
ومن ثم، وفي ضوء ذلك ينبغي تعديل معدلات التبريد والذوبان. مع
باستثناء الخلايا الأكبر حجمًا، يوصى غالبًا بمعدل تبريد يبلغ حوالي 1 درجة مئوية/دقيقة. يتم استخدام المجمدات ذات المعدل المتحكم فيه والتي تعدل درجات حرارة الغرفة
هذا الغرض. بعد الحفظ بالتبريد، يتم تخزين الخلايا من أجل ذوبان الجليد في المستقبل و
الاستخدام المناسب.
على عكس معدل التبريد، لم يتم إعطاء معدل الذوبان الاهتمام الكافي.
ومع ذلك، فمن المستحسن تسخين الخلايا أو إذابتها بسرعة لمنع إعادة بلورة الجليد [47]. يمكن تفسير ذلك بالديناميكا الحرارية لأن الحالة المزججة شبه قابلة للتحول إلى بنية بلورية منخفضة الطاقة عند الذوبان. حالياً،
لتحقيق أقصى قدر من البقاء يقترح نقل كريوفيالس على بخار LN2
وتم تسخينه بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90-120 ثانية [39]. انخفاض في القدرة على البقاء
بعد الذوبان، يعد التعافي أمرًا لا مفر منه، بغض النظر عن مدى جودة تخزين الخلايا و
إذابة. وينبغي الحرص على إزالة الخلايا الميتة في الوقت المناسب باستخدام وسائط الكثافة مثل
فيكول أو طرق أخرى من الخلايا المستردة لزيادة قابلية استعادتها
الخلية قبل الاستخدام يمكن استخدام تدرجات الكثافة لزيادة كثافة الخلايا القابلة للحياة
على الرغم من أن هذه الطريقة غالبًا ما تتضمن تعريض الخلايا لطرد مركزي إضافي قد يكون ضارًا. الاستراتيجيات الحالية لتحديد الخلايا التي تظل قابلة للحياة بعد ذلك
يستخدم الحفظ الفلوروفورات العضوية والأصباغ.
2.3.3 التطورات الحديثة في استعادة الخلايا بعد التبريد
يرتبط إجراء الحفظ بالتبريد الكامل بجهود كبيرة من أجل
الحفاظ على بقاء الخلية ووظيفتها. ومع ذلك، فإن بعض الخلايا المحفوظة بالتبريد
غالبًا ما تظهر انخفاضًا في قابليتها للحياة بعد الذوبان. ولذلك، فمن الضروري
لإزالة الخلايا الميتة وزيادة صلاحية الخلايا الحية. حاليا، العضوية
يتم استخدام الفلوروفور لاختيار الخلايا القابلة للحياة. اختيار خلية قابلة للحياة باستخدام هذا
تُستخدم هذه الطريقة بشكل شائع في العلاج المضاد للفيروسات القهقرية في تكاثر الحيوانات، مثل السائل المنوي/
الحيوانات المنوية للثور والجاموس والأرنب والألبكة والفحل/الحصان والعديد من الأنواع الأخرى
[48-50]. الممارسة السابقة لتحقيق ذلك، تضمنت استخدام تدرج الكثافة.
على الرغم من أن التقنيات المتقدمة باهظة الثمن بعض الشيء، مثل فصل خلايا الألفة المغناطيسية (MACS)، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS)، فقد بدت مفيدة.
[51، 52]. البقاء على قيد الحياة بالتبريد واستعادة الحيوانات المنوية في أنواع مثل الفحل والأبقار وما إلى ذلك.
تم التحقيق باستخدام FACS [53، 54]. استراتيجيات جديدة مثل إدخال
لقد أحدث علم النانو ثورة في مجال علم الأحياء البردي وأرسله إلى المزيد
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
المراحل الأعلى حيث أن فرز الخلايا بوساطة الجسيمات النانوية يكون غير مدمر وأكثر من ذلك
مفيد من نظام مراقبة الأصول الميدانية [55].
2.4 حفظ الحيوانات المنوية
بعد ولادة حية ناجحة مع عينة من الحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد لمدة 21 عامًا، الحيوانات المنوية
كانت الجدوى في العينة المحفوظة بالتبريد واضحة [56]. في الوقت الحالي، اكتسب حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد كوسيلة للحفاظ على الخصوبة أهمية هائلة
وقابلية التطبيق على الإنسان والحيوان [57، 58]. تم العثور على معدل بقاء الحيوانات المنوية
زيادة مع الجلسرين كما CPAs وزيادة تركيز الجلسرين المضافة في
معدل تبريد ثابت للتخزين طويل المدى [59]. يمكن تجميد الحيوانات المنوية عن طريق
إحدى الطريقتين الرئيسيتين الراسختين؛ التجميد البطيء أو التجميد السريع للغاية
[60، 61]. بسبب التأثيرات الضارة للـ SF على النشاط الفيزيوكيميائي للحيوانات المنوية
والحركة، تم اقتراح نهج التجميد السريع ليكون الحل المحتمل للحفاظ على الخلايا دون السماح بنواة بلورات الجليد. حالياً،
ويضمن التجميد فائق السرعة المعتمد التزجيج داخل وخارج الخلية
تحسين بقاء الحيوانات المنوية [62].
2.5 حفظ خصوبة الإناث بالتبريد
مثل الحيوانات المنوية، يمكن تجميد الخلايا الجرثومية الأنثوية عن طريق الحفظ بالتبريد. خصوبة
يعد الحفاظ على الناجيات من السرطان مصدر قلق كبير في علم الأورام ويساعد
تصور. يمكن الحفاظ على الخصوبة عند الإناث عن طريق تجميد البويضة أو الجنين،
البويضات والبويضات داخل أنسجة المبيض. وكانت النتائج مع حفظ البويضات بالتبريد غير مرضية. يتم حفظ أنسجة المبيض بالتبريد على الجانب الآخر
جذبت اهتمام المجتمع الطبي والعلمي. الحفظ بالتبريد
وتناقش بروتوكولات البويضات وأنسجة المبيض لفترة وجيزة أدناه.
2.5.1 حفظ البويضات بالتبريد
لحفظ البويضات بالتبريد، الطرق المعترف بها حاليًا هي استخدام SF
تجميد التوازن وبروتوكولات فيتامين / عدم التوازن. في حفظ البويضات بالتبريد
بواسطة طريقة SF، يتضمن البروتوكول التبريد التدريجي للعينة لخفضها
درجة الحرارة (−150 درجة مئوية) مع معدلات تبريد بطيئة يمكن التحكم فيها في وجود تركيز منخفض من DMSO (1.5 م) بالإضافة إلى السكريات غير المتخللة مثل السكروز أو تريهالوز
بتركيز 0.3 م. يتم تخزين العينات عند -196 درجة مئوية في LN2. معدل البقاء على قيد الحياة
التي حققتها SF لا تزال غير مرضية نسبيا. تشير الأدلة المستمدة من التحقيقات السابقة إلى أن معدلات البقاء على قيد الحياة تصل إلى حوالي 70-80٪ بهذه الطريقة [63]. لذلك،
الطريقة الموصى بها لحفظ البويضات بالتبريد هي التزجيج. بدءًا،
تتم معايرة البويضات بمحلول يحتوي على PEG وDMSO بتركيز 7.5% حجم/حجم.
لمدة 5-15 دقيقة. قبل تخزين الخلايا في LN2، تتعرض الخلايا للتزجيج
الوسائط (PEG وDMSO-15% حجم/حجم، - والسكروز (0.5 م) لمدة دقيقة وتخزينها.
ذوبان الجليد، تتم إزالة CPAs تدريجيا لتجنب تكوين بلورات الجليد. وفي وقت لاحق الخلايا
يتم إحياؤها بعد الحضانة في وسط الثقافة [64]. وكانت النتائج مثيرة للاهتمام
تم الحصول عليها في التحليل المنهجي الذي أجراه أراف وناتان. البويضات المزججة
تم الإبلاغ عن ارتفاع معدلات بقاء البويضات ومعدلات الخصوبة مقارنةً بالبويضات البطيئة التبريد. علاوة على ذلك، لم تلاحظ أي اختلافات في معدل الحمل وتكوين جنين عالي الجودة والتخصيب بين البويضات المزججة والطازجة.
مما يدل بقوة على أن التزجيج هو الإجراء الأفضل للبويضات
الحفظ بالتبريد [65]. خلال السنوات القليلة الماضية، تم تحقيق تقدم كبير
تم تصنيعها في حفظ البويضات من أنواع مختلفة باستخدام التزجيج الجديد
طُرق. معدلات عالية للبقاء والتطور بعد تزجيج السطح الصلب
تم الإبلاغ عن البويضات الناضجة في المختبر من الأبقار [66] والماعز [67].
2.5.2 حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC)
تم تطوير دراسة الببغاء، والتي أسفرت عن ذرية الفئران الأولى، بعد ذلك
كان حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (عند -79 درجة مئوية) والتطعيم المتساوي إنجازًا كبيرًا في
أوائل الستينيات [68، 69]. لاحقًا، مع اكتشافات أخرى لـ CPAs مثل DMSO، والبروبانديول، وجليكول الإيثيلين، تحسنت طرق الحفظ بالتبريد تدريجيًا. يحب
كما يتم الحفاظ على البويضات وأنسجة المبيض بطريقة SF وVit، وخاصة المبيض
الأنسجة القشرية من الثدييات [70]. بعد ظهور فيتامين لحفظ البويضات بالتبريد وبالمقارنة مع SF، يتم الآن النظر في تزجيج أنسجة المبيض
واعدة لحفظ الأنسجة القشرية المبيضية [71، 72]. أنسجة المبيض
يتم إجراء الحفظ بالتبريد بنجاح في العديد من الأنواع الحيوانية مثل الفئران
[68]، النعجة [73]، البقرة ومنها الإنسان [74] وغيرها من الأنواع.
ويبين الجدول 2 المقارنة بين SF وبروتوكول التزجيج للمبيض
حفظ الأنسجة بالتبريد. تم اقتراح التزجيج ليكون له العديد من المزايا
تمت مراجعة SF التقليدي في الخصائص. ومع ذلك، يظل SF هو المعيار
الطريقة السريرية حتى تظهر تقارير أخرى تحسن معدل نجاح فيتامين
تطبق في الاستخدام السريري البشري على SF. حاليا، الغرض الرئيسي من OTC هو الحفاظ على الخصوبة المعروفة حتى الآن، وخاصة لدى الشابات المصابات بالسرطان
أو بعض الأمراض الوراثية التي تدمر احتياطي المبيض. الوصول إلى البويضات غير الناضجة
من بصيلات الغار واستعادة وظيفة الأعضاء، أثارت وجهات نظر جديدة حول فائدة OTC لأسباب اجتماعية إلى جانب الاستخدام الطبي.
2.6 تطبيقات الحفاظ على الخصوبة
من المؤكد أن حفظ الخلايا الجرثومية بالتبريد ظهر كطريقة فعالة لفترة طويلة
مصطلح الحفاظ على الخصوبة في مجال الطب التناسلي لدى كل من الإنسان
والحيوانات. سيكون حفظ الخلايا الجرثومية بالتبريد قابلاً للتطبيق في استعادة الخصوبة لدى الحيوانات والبشر والحفاظ على أنواع الحيوانات المهددة بالانقراض. أكثر من
خلال العقد الماضي، كانت هناك زيادة في إنتاج نماذج GEA من المواد المحفوظة بالتبريد
الموارد الوراثية الحيوانية لاستقصاء الأمراض. أدت ممارسة الهندسة الوراثية إلى زيادة عدد خطوط الفئران والجرذان إلى عشرة أضعاف العدد الفعلي
رقم. حاليًا، يعد حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد تقنية أساسية في المساعدة
تكنولوجيا الإنجاب (ART) مثل التلقيح الاصطناعي (AI)، أو التخصيب في المختبر (IVF)، أو حقن الحيوانات المنوية داخل السيتوبلازم (ICSI). لقد كان الذكاء الاصطناعي نسبيًا هو
الجدول 2.
مقارنة بين SF وبروتوكول التزجيج
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
أهم الممارسات التي تساهم في تقدم الإنتاج الحيواني.
يتم تعزيز العديد من مزايا الذكاء الاصطناعي عندما يتم حفظ السائل المنوي بالتبريد وتخزينه
فترات ممتدة. عدة أنواع مثل الفئران، والأرانب، والخنازير، والماعز، والأبقار، والأغنام
تم استنساخه بنجاح باستخدام حفظ أنسجة المبيض والبويضات بالتبريد
[66-68، 73، 74]. بعد تجربة ناجحة على الحيوانات باستخدام جرثومة محفوظة بالتبريد
الخلايا، وتمتد فائدة الحفاظ على الخصوبة تدريجيا إلى الإنسان. في الوقت الحالي،
تم إجراء عملية الحفظ بالتبريد للبويضات البشرية والحيوانات المنوية لأغراض طبية
أو لأسباب اجتماعية. يتم حل مشكلة العقم عند الأزواج إلى حد كبير. سرطان
المرضى المعرضون لخطر فقدان الخصوبة إما بسبب العلاج الإشعاعي أو الكيميائي
يمكن للنساء اللاتي يرغبن في الحمل في سن متأخرة الاستفادة من الحفظ بالتبريد
التكنولوجيا واستعادة الخصوبة.
2.7 الحدود في الحفظ بالتبريد في النماذج الحيوانية
لقد أحدثت ولادة فأر من جنين محفوظ بالتبريد يبلغ من العمر 50 عامًا ثورة
مجال التكاثر الحيواني. وفي وقت لاحق، لتحقيق نتائج إنجابية أكبر،
لقد تم تحسين بروتوكولات الحفظ بالتبريد بشكل مستمر على مر السنين. في ال
قسم معين، تمت مناقشة عدد قليل من النماذج الحيوانية الهامة.
2.7.1 الفأرة
يعد الفأر أحد النماذج الحيوانية الأكثر استخدامًا في الأبحاث. في وقت مبكر
في التسعينيات، حققت المحاولة الأولى لتجميد الفئران نجاحًا كبيرًا. وفي وقت لاحق، أدى الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية لدى الفئران إلى إنتاج عدد كبير من الفئران
السلالات الفطرية والهجينة [75، 76]. هناك طلب متزايد على الإنتاج
من سلالات الفئران المعدلة وراثيا منذ أن أصبح الماوس الأكثر عمقا
نظام نموذجي لدراسة الوراثة والمرضية للأمراض البشرية.
علاوة على ذلك، بدأت المشاريع المغلوب في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية على مدى عقد من الزمن. مثل الحياه
إن الحفاظ على العدد المتزايد من الفئران أمر صعب وغير اقتصادي
في المختبرات الحيوانية، يوفر حفظ المادة الوراثية بالتبريد وسيلة قيمة
الحفاظ على سلالات الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة في البحوث الطبية الحيوية [77]. علاوة على ذلك،
يتم الآن بنجاح حفظ الأمشاج الحيوانية – الحيوانات المنوية والبويضات والأجنة
يتم حفظها وصيانتها في البنوك المبردة بفضل تقنية الحفظ بالتبريد.
تاريخيًا، كان حفظ الأجنة بالتبريد بمثابة المعيار الذهبي للحفاظ على سلالات الفئران المعدلة وراثيًا ذات طفرات مفردة أو متعددة، أو جينات معقدة.
الخلفية [78، 79]. ومع ذلك، غالبًا ما يكون أكثر تكلفة بسبب إجراءات الإباضة الفائقة المكلفة والمستهلكة للوقت والحفظ بالتبريد اللاحق. لكن،
يعد حفظ الحيوانات المنوية بالتجميد للتخزين طويل الأمد أمرًا بسيطًا وغير مكلف،
ولا يتطلب الأمر سوى عدد قليل من الحيوانات المانحة لحماية تلك السلالات شائعة الاستخدام
سلالات (على سبيل المثال، C57BL/6، FVB، و129/Sv) مع طفرات واحدة [80]. وهكذا الحيوانات المنوية
ويوفر الحفظ بالتبريد إدارة فعالة لهذه الموارد الجينية
عن طريق تقليل مساحة الصيانة والتكلفة وحمايتها من
على سبيل المثال، المرض، وفشل التكاثر، والانحراف الوراثي.
على الرغم من أن بروتوكولات حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد الحالية أظهرت نجاحًا مرتفعًا نسبيًا، إلا أنه كان هناك اختلاف في حركة الحيوانات المنوية ونتائج التلقيح الاصطناعي بعد ذوبان الجليد.
قام العديد من الباحثين بالتحقيق والعمل على تطوير البروتوكول القياسي الذهبي لـ
تجميد الحيوانات المنوية للفئران. أصبح بروتوكول ناكاجاتا هو الأكثر استخدامًا من قبل الكثيرين
مختبرات الأبحاث والمرافق السريرية والعلمية حول العالم [80].
يحتوي محلول التجميد الأولي ببساطة على 18% حليب خالي الدسم و3%
رافينوز في الماء، ويتحقق التبريد في مرحلة بخار LN2 لمدة 5 دقائق تليها
عن طريق غمر العينات في LN2 عند -196 درجة مئوية. منذ تقديم هذا الأولي
البروتوكول، كانت هناك تغييرات قليلة في محاولة لتحسين إمكانية التخصيب بعد ذوبان الجليد للحيوانات المنوية الماوس.
لحفظ الحيوانات المنوية بالتبريد في الفأر، يتم جمع الحيوانات المنوية من البربخ
يتم تعليق ذيل البربخ لدى الفئران الذكور الناضجة في مادة الحماية من البرد المعتمدة على السكر، والتي يتم تحميلها في القش المتجمد وحفظها عند درجة حرارة -196 درجة مئوية [81]. ال
يمكن استخدام الحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد للتخصيب الفعال باستخدام التلقيح الاصطناعي المحسن
أنظمة تحتوي على ميثيل-بيتا-سيكلوديكسترين (MBCD) والجلوتاثيون المخفض (GSH)
[82، 83].
قام العديد من العلماء في جميع أنحاء العالم بالتحقيق في دور مضادات الأكسدة المتنوعة مثل مونوثيوجليسرول [84]، ميثيل بيتا سيكلودكسترين (MBCD) [82] و
وكان آخر التحسينات هو إدخال الجلوتاثيون المخفض (GSH) للحماية
الحيوانات المنوية ضد الإجهاد التأكسدي أثناء علاج التلقيح الاصطناعي [83] وزيادة
معدلات الإخصاب. C57BL/6 هي سلالة فطرية رئيسية تستخدم لإنتاج الفئران المعدلة وراثيا، وأيضا باعتبارها تهجين خلفي للفئران الطافرة المستهدفة [85]. ظزولاؤ
من الضروري إنشاء طريقة الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية للفئران C57BL/6
التي يمكن أن تحافظ على قدرة تخصيب عالية بعد الذوبان. في الآونة الأخيرة، أظهرت وسيلة ما قبل الحضانة التي تحتوي على ميثيل بيتا سيكلوديكسترين المستخدمة زيادة
الخصوبة [82]. علاوة على ذلك، يتم زيادة الحيوانات المنوية التي تم تجميدها في وسائط التبريد التي تحتوي على
18% رافينوز و 3% حليب خالي الدسم يزيد معدل الإخصاب [86]. الخدمات المصرفية للحيوانات المنوية
يمكن استخدامه مع الفئران، ولكن في بعض الحالات من المهم أيضًا حفظ الأنثى
الجينوم [87].
علاوة على ذلك، يتم حفظ الأمشاج المبيضية بالتبريد، مثل البويضات المحصودة أو المحتواة
داخل البصيلات البدائية في أنسجة الرقعة القشرية، يمكن استخدامها على المدى الطويل
تخزين السلالة الأنثوية [88]. بروتوكول الحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض
استنادا إلى إجراءات التبريد البطيء تم تطويرها في البداية واستخدامها للماوس
البيض والأجنة في السبعينيات [10]. تتطلب هذه العملية معدلًا بيولوجيًا يتم التحكم فيه
الفريزر أو المعدات المماثلة. لقد تم توثيقه الآن أن كلا من الفأرة طازجة
والطعوم المجمدة المذابة لديها القدرة على استعادة الخصوبة على المدى الطويل (أي
سنة واحدة) إلى متلقي الكسب غير المشروع [89]. تقدم أحدث في مدة الكسب غير المشروع
وتكون الوظيفة في حالة أنسجة المبيض المزروعة بالكسب غير المشروع وظيفية
لمدة 5 سنوات، أو أكثر استمرارًا لأكثر من 9 سنوات [90]. لقد طغى على التجميد البطيء تطور نظام التزجيج المغلق الأكثر تقدمًا والذي تم إثباته
أكثر فائدة في حفظ المبيض بالتبريد.
2.7.2 الفئران
النموذج الحيواني الذي يشارك أيضًا بشكل شائع في العمل العلمي هو الفئران،
بشكل رئيسي في علم الأحياء الأساسي وعلم وظائف الأعضاء وعلوم الدماغ والطب. منذ أكثر من 40 عامًا،
تم الإبلاغ عن نجاح التلقيح الاصطناعي في الفئران. الخصائص، مثل فترة الحمل القصيرة
وعمر قصير نسبيًا، وسلوك سهل الانقياد، وتوافر الحيوانات بسهولة
مع الخلفيات الصحية والوراثية المحددة جيدًا تجعل الفئران تجربة مثالية
نموذج. يعد الجرذ نوعًا قياسيًا لاختبارات السموم والمسخات والسرطان من قبل صناعة الأدوية والهيئات التنظيمية الحكومية [91، 92]. لا يزال يتم استخدام الفئران لأغراض غذائية وعصبية و
دراسات الغدد الصماء. لم يتم إجراء الحفظ بالتبريد في الفئران في كثير من الأحيان
كما حدث في الفئران، لكن هذه التقنية أصبحت أكثر انتشارًا لنفس الغرض
أسباب استخدامه على نطاق واسع في الفئران. يمكن أن يكون الحفظ بالتبريد وسيلة فعالة
الحفاظ على إمكانية تربية الفئران الحية بالآلاف وراثيا
الأنماط الجينية المعدلة المتاحة حاليا [93، 94]. هناك عملية حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد
وكانت ناجحة بالمثل في الفئران. يتم الحصول على النسل من الحيوانات المنوية المذابة باستخدام
التلقيح داخل الرحم أو عن طريق التلقيح الاصطناعي. سيتا وآخرون، [95] أنشأوا لأول مرة أ
نظام التلقيح الاصطناعي الناجح باستخدام الحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد [95]. بروتوكول معمم
يتم إجراء التلقيح الصناعي في الجرذان (والسلالات المماثلة) من الحيوانات المنوية والبويضات المحفوظة بالتبريد
موضح في الشكل 3.
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
الشكل 3.
تمثيل تخطيطي لتقنيات الإنجاب المساعد والتخصيب في المختبر؛ التلقيح الاصطناعي في الفئران من
الحيوانات المنوية والبويضات المحفوظة بالتبريد.
2.7.3 الأرنب
يعد الذكاء الاصطناعي في الأرانب باستخدام السائل المنوي المبرد والمخزن لفترة قصيرة من أكثر ممارسات العلاج المضاد للفيروسات القهقرية شيوعًا
في بلد مثل أوروبا، حيث تربية الأرانب أمر شائع [96، 97]. معدلات خصوبة عالية
ويتم الحصول على الانتشار في هذه العملية. ومع ذلك، مع وجود عوامل مقيدة مثل انخفاض
الإنتاجية والقضايا المتعلقة بالحيوانات المنوية للأرنب المحفوظة بالتبريد، يتم استخدام الذكاء الاصطناعي في التجارب
أو أغراض بنك الموارد الجينية. على الرغم من عدم استخدام الحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد
للأغراض التجارية في الوقت الحاضر، هناك حاجة لطرق موثوقة للحيوانات المنوية للأرانب
الخدمات المصرفية للموارد، خاصة وأن هذا النوع حيوان ذو قيمة في العلاج
إنتاج اللقاحات والأجسام المضادة والهرمونات) [98، 99]. مدى الإصابة بالتبريد
يختلف باختلاف الأنواع بسبب الاختلافات في تكوين غشاء البلازما الأمشاج
من بينها وحجم الخلية أيضًا [100]. وبالتالي، لا يوجد بروتوكول عالمي متبع
لجميع أنواع الحيوانات. من الضروري توحيد بروتوكول الحفظ بالتبريد،
مستويات وتكوين الموسعات و CPAs لكل نوع أو حتى سلالات.
لاحظ الباحثون نتائج متفاوتة بشكل كبير مع نوع اتفاق السلام الشامل
يستخدم في حفظ الحيوانات المنوية لدى الأرانب. استخدام CPAs مثل DMSO أو الإيثيلين
يوصى باستخدام الجليكول لتعزيز تخزين الحيوانات المنوية للأرانب [101]. قليلة أخرى
لاحظت الدراسات أن جلايكول الإثيلين أقل سمية من الجلسرين في الأرانب المجمدة
الحيوانات المنوية. على الرغم من انخفاض سميته، فشل جلايكول الإثيلين في توفير الحماية للحيوانات المنوية
الخلايا بالمقارنة مع DMSO الأخرى. الأهم من ذلك، يجب أن يكون تركيز اتفاق السلام الشامل
الأمثل لحماية كافية. تجدر الإشارة إلى إضافة CPAs عند 5 درجات مئوية بدلاً من 37 درجة مئوية
تم الإبلاغ عن فعاليته في حفظ الحيوانات المنوية للأرانب بالتبريد مع زيادة النفاذية
مع ارتفاع درجات الحرارة [102]. بيانات عن نوع اتفاق السلام الشامل وتركيزه
الحفظ بالتبريد الأمثل أمر متناقض. ومع ذلك، فمن الموثق جيدًا أن أ
يعد التوازن بين جميع المعلمات المعنية هو مفتاح التجميد الناجح. الحيوانات المنوية
تختلف الجودة باختلاف نوع الموسعات المستخدمة. الموسعات المستخدمة للحيوانات المنوية للأرنب
يشمل الحفظ بالتبريد مزيجًا من CPA النفاذية وغير النفاذية. ال
يعد استخدام اثنين من اتفاقات السلام الشامل المنفذة ممارسة شائعة [103]. الحيوانات المنوية مجمدة في الأسيتاميد
تم العثور على أن الموسع ذو جودة أعلى من الحيوانات المنوية DMSO والجلسرين أو
موسعات أخرى مخلوطة [104]. خليط CPA مع صفار البيض له فرق
التأثير على نوعية الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية مجمدة في موسع يحتوي على صفار البيض و
أظهر DMSO جودة أفضل للحيوانات المنوية مقارنة بالحيوانات المنوية المجمدة في الموسع
التي تحتوي على نسبة عالية من DMSO وتفتقر إلى صفار البيض [102]. ومن هنا فمن الواضح أن أ
التوازن بين جميع العوامل الأساسية هو مفتاح التجميد الناجح.
في الآونة الأخيرة، قام دومينغو وآخرون، [105] بدراسة المقارنة بين موسعات السائل المنوي المختلفة وعوامل الحماية من البرد لتعزيز الحفظ بالتبريد للحيوانات المنوية في الأرانب
ووجدت أن إضافة ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) إلى INRA 96® يؤدي إلى
تأثير وقائي على غشاء الحيوانات المنوية وتحسين نوعية الحيوانات المنوية [105].
على الرغم من بذل العديد من الجهود لتحسين موسعات الحفظ بالتبريد و
بروتوكولات الحيوانات المنوية للأرانب، لا تزال هناك العديد من الأسئلة دون إجابة. بالإضافة إلى حفظ الحيوانات المنوية بالتبريد، تعمل القوارض كنموذج لحفظ أنسجة المبيض و
إجراءات الزرع للتطبيق الحالي والمستقبلي والاستخدام السريري في
الانسان. زاد إنتاج نماذج القوارض المعدلة وراثيًا لأبحاث الأمراض
عقد من الزمن باستخدام تقنيات تحرير الجينات (مثل كريسبر/كاس9).
2.7.4 الحفظ بالتبريد من القوارض إلى الحيوانات الكبيرة
من القوارض إلى الحيوانات الكبيرة، ثبت أن الحفظ بالتبريد مفيد في
الحفاظ على الخصوبة وزرع وتربية الماشية. كان التقدم في مجال الحفظ بالتبريد رائدًا في زراعة الفئران البدائية المحفوظة بالتبريد
بصيلات في عام 1993 من قبل ج. كارول و ر. جوسدن [106]، تليها التعرف على الأغنام
كنموذج أكبر لدراسة وظيفة المبيض. جوسدن بالتعاون مع د. بيرد
[107]، طور تقنيات مفاغرة الأوعية الدموية التي شكلت الأساس
زراعة الأعضاء الكبيرة مثل الكلى في الإنسان. التطور
اكتسبت تقنيات ART أهمية في إنتاجها تجاريًا
سلالات حيوانات المزرعة الهامة وعدد قليل من الأنواع الغريبة أو المهددة بالانقراض. الثروة الحيوانية
وقد استفادت الصناعة وخاصة الماشية إلى حد كبير من التطبيق
من السائل المنوي أو الأجنة المحفوظة بالتبريد على مدى العقود الماضية. وكان هذا هو الحال أيضا
في تجربة حفظ الأمشاج بالتبريد. الحيوان الأكبر مثل الأغنام بشكل كبير
وأكد على دراسة الأمراض التي تصيب الإنسان وخاصة أمراض الجهاز التنفسي والرئة
السرطان، حيث أن تشريح وفسيولوجيا الجهاز التنفسي للأغنام أكثر
تشبه تلك الموجودة لدى البشر مقارنة بالقوارض. وقد تم اقتراح الأغنام كنموذج جيد
للقاحات وإمراض الربو وعلاجات الاستنشاق [108]. التدريجي
إن تراجع التنوع الوراثي في السلالات المحلية يشكل تهديدا كبيرا على الثروة الحيوانية،
ومن ثم، يسعى المجتمع الدولي جاهدا للحفاظ على وراثة الثروة الحيوانية.
تم تجميد السائل المنوي من معظم أنواع الثدييات بنجاح [109].
فيما يتعلق بتحمل درجة الحرارة، تظهر الحيوانات المنوية من الأنواع المختلفة
ردود متنوعة. تظهر الحيوانات المنوية البقرية قدرة أعلى على تحمل درجات الحرارة المنخفضة، بينما
تعتبر الحيوانات المنوية من الخنازير والأغنام أكثر حساسية ومعرضة لخطر الصدمة الباردة عند التعرض لها
إلى درجة حرارة تتراوح بين 5 إلى 22 درجة مئوية مما يؤدي إلى فقدان الحيوية بسرعة. الحيوانات المنوية هي
معرضة بشدة للضرر التأكسدي بسبب فقدان إنزيم مضاد الأكسدة و
زيادة أكسدة الأحماض الدهنية عند التجميد [110]. استقرار وحيوية الحيوانات المنوية
يتم تعزيزه عن طريق إضافة موسعات السائل المنوي أثناء التجميد. أول موسع للسائل المنوي
لحفظ الحيوانات المنوية البقرية، تم استخدام مادة مخففة من صفار البيض وسيترات الصوديوم (EYC).
وتم استبداله تدريجيًا بصفار البيض المخفف بالتريس (TRISEY) أو التريس الفركتوز.
صفار الجلسرين [111]. تستخدم معظم الصناعات التريس والسيترات كمكونات نشطة
في موسعات الحيوانات المنوية البقرية. وجد أن إضافة مركبات مثل فيتامين E إلى موسعات السائل المنوي تزيد من السلامة الهيكلية للأكروسوم، وبالتالي تمنع حدوثه
الحيوانات المنوية من الأضرار التأكسدية عن طريق خصائصها المضادة للأكسدة [24].
2.7.5 التزجيج في الحيوانات الكبيرة
تم اختراع تزجيج الأجنة في عام 1985 [112]. ظهر التزجيج في وقت لاحق
باعتبارها واحدة من الطرق القوية لحفظ الأجنة من حيوانات المزرعة بالتبريد
طرق الحفظ بالتبريد والحدود في فن تجميد الحياة في النماذج الحيوانية
دوى: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.101750
ومنها البقر والماعز والغنم والخنزير [28، 29، 113، 114]. ولادة العجل الأول
تم الحصول عليها من البويضات المجمدة/المذابة في عام 1992 [115]. التزجيج
أظهر نجاحًا كبيرًا في حفظ البويضات البقرية بالتبريد في عام 1998 [116]. القابلية للتطبيق
من الجزيئات الكبيرة ذات السمية الأقل مثل CPAs، واستخدام التبريد والسطح الصلب
ظهرت عملية التزجيج تدريجيًا مع مرور الوقت للتغلب على الإصابة بالتبريد. العلاج ب
قام الدوسيتاكسيل بتحسين عملية حفظ البويضات البقرية كوسيلة وقائية ضدها
وبالتالي فإن إصابة الهيكل الخلوي يمكن أن تعزز معدل البقاء على قيد الحياة بعد الذوبان
البويضات [117]. تم الإبلاغ عن معدلات عالية للبقاء والتطور بعد تزجيج السطح الصلب للبويضات الناضجة في المختبر من الأبقار [66] والماعز [67].
يستخدم SSV سطحًا معدنيًا، يتم تبريده مسبقًا إلى -180 درجة مئوية عن طريق الغمر الجزئي في السائل
النيتروجين، لتبريد قطرات صغيرة من محلول التزجيج الذي يحتوي على الأجنة أو
البويضات.
تم الإبلاغ عن نجاح OTC في استعادة وظيفة المبيض في الأغنام
نموذج. استعادة كاملة لوظيفة المبيض الحادة وبنسب عالية من الطبيعية
تم الحصول على الخصوبة مع العديد من الولادات الحية بعد حفظ المبيض بالكامل وزرع ذاتي لمبيض الأغنام البالغة [29]. على الرغم من أنسجة المبيض
لقد تطور الحفظ بالتبريد من التجارب التي أجريت على الأغنام في أوائل التسعينيات
أصبح الآن معروفًا كإجراء ناجح نسبيًا لـ OTC في الإنسان،
خاصة للحفاظ على خصوبة مرضى السرطان لتجنب أضرار الغدد التناسلية
الناتجة عن العلاج [118]. في حين كان هناك نجاح كبير مع
الحفظ بالتبريد للبويضات والأجنة والسائل المنوي في حيوانات المزرعة، هذه التكنولوجيا
لا يزال يتطلب التحسين ومواصلة تحسين الدراسات.
3 - الخلاصة
بناءً على فائدة الحيوانات وحاجتها لأغراض متنوعة، يتم تحديد الخصوبة
فالحفظ شرط أساسي لممارسته في تربية الحيوان والحيوان
وحدة منزلية لإنتاج النماذج الحيوانية. فهم أساسيات
يسمح الحفظ بالتبريد بتطوير إجراءات أكثر كفاءة لحفظ الخلايا الجرثومية بالتجميد وتوسيع نطاق تطبيقاتها وفائدتها السريرية
في الماشية، والتي يمكن أيضًا نقلها إلى التطبيق البشري. على الرغم من أن
لقد تقدم مجال علم الأحياء البردي على مر السنين، ولا يزال هناك حاجة إلى مزيد من البحث
لتحسين تركيز المادة الواقية من البرد، ومعدلات التبريد والذوبان لتحقيق أهداف عالية
النجاح في التكاثر الحيواني.
تعليقات
إرسال تعليق